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内切-β-甘露聚糖酶MAN5的酶学性质及其在魔芋粉低聚糖生产中的应用

陈倩婷 译

(广州博仕奥集团  510663)

选译自Min Zhang, Xiu-Lan Chen, Zhi-Hua Zhang, etc. Purification and Functional Characterization of Endo-β-Mannanase MAN5 and Its Application in Oligosaccharide Production from Konjac Flour. Appl Microbiol Biotechnol,2009, 83:865–873.

  要:MAN5是芽孢杆菌MSJ-5主要的胞外多糖水解酶,其为内切-β-甘露聚糖酶,能有效切断至少5个糖基。MAN5最适pH5.5,最适温度为50,在pH 5-9和温度低于65时酶活稳定。MAN5对魔芋粉有很强的水解能力,50添加10 U/mg MAN510min能完全液化魔芋粉。HPLC分析显示魔芋粉中大部分葡甘露聚糖水解为大量具有2-6个糖基的低聚糖和少量的单糖。制备魔芋胶低聚糖的最佳工艺为:添加10 U/mg甘露聚糖酶至10 mg/mL魔芋粉中,50水解24h。在此水解条件下,超过90%魔芋粉多糖被水解为低聚糖和少量单糖(占低聚糖的2.98%)。在中国,魔芋粉是低商业价值而未被利用的农副产品,通过添加甘露聚糖酶MAN5对魔芋粉进行水解,魔芋粉能被充分利用,产生高附加值的产品低聚糖,其工艺高效和廉价显示出其在工业中应用的潜力。

关键词:内切-β-甘露聚糖酶  MAN5  低聚糖的制备  魔芋粉  芽孢杆菌MSJ-5

1  前言

在过去的二十年,多种类型的低聚糖由于具有生理保健作用和对人类健康有益而快速地发展。某些低聚糖,如葡萄糖基蔗糖、低聚果糖、低聚麦芽糖、异麦芽寡糖(具支链的低聚糖)、低聚半乳糖、木寡糖、异麦芽酮糖(帕拉金糖)和乳果糖已形成工业化生产。相比较,甘露低聚糖却得到较少的关注。甘露低聚糖是不可消化的低聚糖,是高膳食纤维和益生元,具有重要的生理特性。甘露低聚糖能促进肠道微生物的生长,特别是双歧杆菌能减少肠道致病细菌,调节免疫反应,提高肠道粘膜的完整性,因此能提高人类健康水平和养殖动物的价值。Lu等报道魔芋粉中的四糖有益于糖尿病治疗,这说明了甘露低聚糖作为有价值的低聚糖具有发展前景。尽管利用来源于细菌、真菌和植物的甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖生产甘露低聚糖的文献报道很多,但是缺乏一种经济和可行的工艺生产甘露低聚糖。

魔芋在亚洲有大范围的种植,特别是在中国。在中国,每年收割大概1300000吨(鲜重)的魔芋,魔芋粉是低商业价值的、未被充分利用的农副产品,在食品工业中作为凝固剂和增厚剂使用。由于葡甘露聚糖是魔芋胶粉的主要组成成分,所以魔芋粉是制备甘露低聚糖的最佳原料。

本文中产甘露聚糖酶的菌株是芽孢杆菌MSJ-5,筛选自中国四川省的魔芋种植地。利用MSJ-5所生产分泌的β-甘露聚糖酶MAN5水解魔芋粉制备低聚糖,工艺成本既便宜又高效。

2  材料与方法

2.1  芽孢杆菌MSJ-5 β-甘露聚糖酶发酵条件

芽孢杆菌MSJ-5接种于装有50mL最佳液体培养基的500mL三角瓶中,培养基组成为:25g/L魔芋粉、35g/L酵母提取物、10g/L豆粕、5g/L KH2PO4 (pH 7.0),32,220rpm的培养条件下培养32h后,β-甘露聚糖酶的酶活达到最大值10,000×g4离心15min取上清为粗酶液。

2.2  β-甘露聚糖酶酶活测定及定义

β-甘露聚糖酶酶活测定按Zhang等人的方法进行测定。具体方法是:0.1mL经适度稀释的酶液中加入0.9mL 0.5%洋槐豆粉溶液,洋槐豆粉溶液用20mM pH 6.0磷酸盐缓冲溶液配制,50℃反应10min,利用DNS法测定还原糖(以甘露糖表示)含量,生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

2.3  β-甘露聚糖酶MAN5的酶学性质

为确定β-甘露聚糖酶最佳反应温度,将酶液于pH 5.535-70下反应;另取酶液于不同温度(35-70)下保温1h以研究酶热稳定性,剩余酶活力于pH 5.550条件下测定。50pH 3.0-10.0下进行酶最适pH的研究,其中pH 3.0-6.0的溶液由20mM柠檬酸缓冲液配制,pH 6.0-8.0的溶液由20mM磷酸盐缓冲液配制,pH 8.0-10.0由20mM甘氨酸-NaOH缓冲液配制。β-甘露聚糖酶MAN5于上述不同pH缓冲液中保温1h,研究pH值对酶热稳定性,剩余酶活力于pH 5.5和50条件下测定。50℃,酶浓度为([E])0.25 U/ml,2.5-45g/L洋槐豆粉或魔芋粉为底物以确定反应初速度,再根据米氏方程与双倒数作图法Lineweaver-Burk plots)画出线性方程确定Km和Vmax值。

2.4  MAN5水解魔芋粉制备低聚糖的最佳工艺

考察不同浓度β-甘露聚糖酶和不同浓度魔芋粉对制备低聚糖工艺的影响,50℃保温一定时间后,沸水浴5min灭酶,10,000×g,4℃离心15min,取上清经硝酸纤维素滤膜(0.22μm)过滤后进行HPLC分析,分析其产物的糖类类型,以确定最佳工艺条件。

3  结果与分析

3.1  菌株芽孢杆菌MSJ-5的特征与鉴定

菌株MSJ-5筛选自魔芋胶种植地,其在洋槐豆粉筛选培养基中能形成大的水解圈,所以它具有较高的β-甘露聚糖酶生产能力。MSJ-5是革兰氏阳性细菌,呈杆状(0.7-0.8×2.1-3.0μm),没有鞭毛(见图1)。经过48h培养,形成椭圆形的内生芽孢。培养36h内,菌落呈白色,圆形且有完整的边缘,36h后菌落在平板上快速生长,菌落边缘形成锯齿状。提取16SrRNA测序,与GenBank数据库作对比,与芽孢杆菌属的同源性超过了99%,可以断定菌株MSJ-5属于芽孢杆菌属,取名为芽孢杆菌MSJ-5

3.2  芽孢杆菌MSJ-5甘露聚糖酶发酵条件和酶学性质

在最佳培养基中培养32h,β-甘露聚糖酶酶活为651±31U/mL,与之前报道过的酶活要高。粗酶能有效降解甘露聚糖,部分降解可溶性淀粉,不能降解纤维素和木聚糖,这说明在发酵培养基中,甘露聚糖酶是主要的糖类水解酶。

以洋槐豆粉为底物,MAN5最适pH为5.5。pH 6-9,50保温1h后,剩余酶活力(relative activity)超过70%。MAN5最适温度为50-60。35-65保温1h后,剩余酶活力保持在50%以上,保温温度超过65℃酶活力迅速下降,如图2。

Ag+ Fe3+ 强烈抑制酶的活性,Mn2+ Cu2+抑制了35-40%的酶活, Li+ Zn2+ Fe2+对酶活影响不大,在所有离子中,没有一种离子对MAN5起明显的促进作用,Co2+只能提高酶活8.6%,与对照相比较,添加EDTA使剩余酶活为33.9%,结果见表1。

Zn2+

86.1±6.6

  EDTA

33.9±6.4

a所用离子和EDTA浓度为1mM,没加任何试剂的为对照,其相对酶活为100%,每组实验做3个平行。

MAN5以魔芋粉为底物时Km值比洋槐豆粉小,说明魔芋粉适合做底物,然而,MAN5对魔芋粉的催化效率(Kcat/Km )略低于洋槐豆粉,结果见表2,同时MAN5酶活没受到甘露二糖(0.1-0.4mM)的抑制。

3.3  β-甘露聚糖酶MAN5水解魔芋粉制备低聚糖的最佳工艺

为了发展既经济且可行的生产技术,本文优化了β-甘露聚糖酶MAN5水解魔芋粉制备低聚糖的工艺条件。由于甘露聚糖酶是发酵液体培养基中主要的糖类水解酶,所以芽孢杆菌MSJ-5发酵产物的上清液可作为粗酶液,应用于工艺中以降低生产成本。首先是研究最佳的底物浓度,0.1 U/mg酶添加至浓度1-30 mg/mL的魔芋粉中,水解1h,测定水解产物中的还原糖含量及其与魔芋粉浓度之比,结果显示当魔芋粉浓度超过10 mg/mL,还原糖与魔芋粉浓度比值不再增长,因此,10 mg/mL为最佳魔芋粉浓度。往10 mg/mL魔芋粉中分别添加1,5,10 U/mg甘露聚糖酶,水解1h后对产物进行HPLC分析。HPLC结果显示,添加5 U/mg甘露聚糖酶水解魔芋粉后,水解产物中含2-6糖基的低聚糖占总糖的72.6%,使用10 U/mg甘露聚糖酶水解后含2-6糖基的低聚糖占总糖的77%,可以看出,5-10 U/mg甘露聚糖酶是最佳的酶添加量。10 mg/mL魔芋粉中添加10 U/mg甘露聚糖酶,50保温20min,1,2,1224和48h后分别对水解产物进行分析(见图3),反应时间对产物组成的影响见表3。当魔芋粉水解24h时,含2-6糖基的低聚糖占总糖的90.9%,水解48h的低聚糖含量没有太大增加,所以,24h是最佳水解时间。综合所述,β-甘露聚糖酶MAN5水解魔芋粉制备低聚糖的最佳工艺为10 U/mg β-甘露聚糖酶MAN5、10 mg/mL魔芋粉50℃保温24h,达到90%以上的魔芋粉多糖水解成含2-6个糖基的低聚糖,还含有少量的单糖(占低聚糖的2.98%)。

4  讨论

由于低聚糖具有保健作用,所以被广泛应用在食品、饮料和糖果中,特别是功能保健食品。现在主要通过酶解淀粉、几丁质、木聚糖和甘露聚糖等糖类物质制备低聚糖。葡甘露聚糖是甘露糖和葡萄糖通过β-1,4-糖苷键以1.6:1的比例组成的,是制备低聚糖的生产材料,而葡甘露聚糖是魔芋粉的主要组成成分,在中国,魔芋粉的产量非常大,其价格也非常便宜(30-50美元/吨),应该是生产低聚糖既便宜又优良的原料,然而以魔芋粉为原料制备低聚糖的文献报道非常少。

为研究通过酶解魔芋粉制备低聚糖,有必要挑选出能高效水解魔芋粉的β-甘露聚糖酶。在本文中,内切-β-甘露聚糖酶MAN5具有强的水解魔芋粉能力,它由筛选自魔芋种植地的芽孢杆菌MSJ-5分泌产生,甘露聚糖酶是其主要分泌的胞外糖类水解酶,在培养基中检测不了纤维素酶和半纤维素酶的活力。因此,发酵产物上清液不需要提纯,能直接作为甘露聚糖酶粗酶液直接水解魔芋粉。与大量文献所报道的β-甘露聚糖酶相类似,MAN5最适反应pH5.5,最适反应温度为50°C,酶在pH 5-9和低于65°C稳定,酶解最终产物甘露二糖对MAN5酶活无抑制,MAN5这些酶学性质使其作为水解酶应用于水解工艺中。MAN5是严格的内切-β-甘露聚糖酶,能高效水解至少含有5个糖基的糖类。转糖基作用是多数β-甘露聚糖酶的共同特性,其也出现在MAN5水解甘露寡糖的过程中。MAN5最突出的特点是能高效地水解魔芋粉,50°C只需10min,添加10 U/mg MAN5就能完全水解液化魔芋胶,同时,HPLC分析显示魔芋粉大部分的葡甘露聚糖水解为含2-6个糖基的低聚糖和少量的单糖,这可能与转糖基作用有关。

由于MAN5具有高效水解魔芋粉制备低聚糖的能力,是菌株MSJ-5发酵液主要的糖类水解酶,能开发将菌株MSJ-5发酵产物上清液添加至魔芋粉中制备低聚糖的工艺,既经济又可行。最佳的水解工艺: MAN5粗酶液浓度10 U/mg,底物魔芋粉浓度10 mg/mL50°C保温24h。在此水解条件下,魔芋粉超过90%糖类物质水解为含2-6个糖基的低聚糖和少量的多糖(占低聚糖的2.98%),据知,这是第一篇水解魔芋粉制备低聚糖的报道,虽然这是实验室实验结果,但是此工艺的高效性和廉价性在工业生产中具有广阔的前景。

(参考文献略,需者可函索)

 

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