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饲料酶制剂应用效果的评价体系

冯定远 左建军

(华南农业大学动物科学学院 510642

酶制剂应用效果的评价不像一般的营养成分或添加剂那样相对容易。许多时候,即使酶制剂是有效的,是有针对性的,但未必能够在动物的生产性能中反映出来。酶在动物日粮中应用更多的是表现出生产性能指标或试验数据差异不显著,在这种情况下,仅仅用传统的动物生产性能指标(生长增重和饲料报酬)评价方法并不能完全反映酶的作用及其效果,必须建立综合评价体系。一般地,这种评价体系可以考虑包括如下几个方面:1)酶制剂活性的评定;2)酶制剂稳定性的评定;3)酶制剂应用主要生产性能评定;4)酶制剂应用效果的非常规评定等。其中酶制剂活性的评定是最基本的评价方法,也是非饲料用酶的评价方法。这里重点讨论与饲料用酶有关的其他评价方法,有时候,酶制剂应用效果的非常规评定方法往往是体现饲料酶制剂效果的敏感指标。

1 酶制剂稳定性的评定

1.1 温度对酶制剂稳定性的影响

由于酶是具有一定结构的活性蛋白质,其活性中心(催化位点)易受到温度影响而失活变性。温度对外源酶稳定性的影响主要在二方面,其一是酶制剂本身的最适作用温度;其二是酶制剂应用于饲料工业耐受调质制粒温度。一般来说,每一种酶制剂都有其最适作用的温度范围,超出此范围则该种酶制剂活性很低或失活。在我们实验室的试验通过体外法测定出4种外源酶的最适作用温度:α-淀粉酶的酶活最高时的温度是4060℃,超过70℃,活性降低;木聚糖酶酶活最高时的温度是3040℃,大于50℃,酶活降低,超过70℃,则酶失活;β-葡聚糖酶酶活最高时温度是3040℃,大于50℃,则酶活急剧下降,超过70℃,则酶失活。说明每一种酶制剂均有其耐温特性。通常微生物酶比动物体内的酶耐高温,主要原因在于微生物酶来源于菌株发酵,发酵过程中的温度要高于动物体温。据安永义(1997)测定,淀粉酶在60℃左右活性最高;于旭华(2001)测定微生物来源的淀粉酶和纤维素酶的最高活性都是在温度为60℃时取得。与在我们实验室的试验的差异主要在于酶的来源不一致,因为不同来源酶的特性是不同的。因此,对于不同来源酶的耐温特性需采取同一方法测定,便于相互比较。由于酶制剂种类较多,来源不一,有关其他各种酶的耐温特性有待于进一步研究。

外源酶制剂应用于饲料工业的一个焦点问题是酶制剂在制粒过程中的耐温性。饲料调质制粒往往有7090℃的温度,这样的温度有可能使酶发生变性。以往零星的有关酶制剂耐温试验是在实验室的烘箱中进行的,不能反映饲料生产的真实过程及饲料成分的复杂性对酶的影响,因而缺乏实际的意义。在我们的试验中采用实际生产条件,通过温度的调控来研究二种来源酶制剂的制粒耐温性能。结果发现,淀粉酶在制粒温度不超过85℃仍有较高的保存率;酸性蛋白酶在制粒温度75℃时酶活保存率在80℃以上;液体发酵的β-葡聚糖酶和木聚糖酶在制粒温度为85℃时仍有70%左右的活性。并且试验证实,液体发酵的外源酶的耐温性能要高于固体发酵的外源酶,原因主要在于对液体发酵的各种外源酶可以根据其耐温性能进行稳定化处理,而固体发酵的酶制剂则难以做到这一点。安永义(1997)用大麦-豆粕日粮混入经耐温处理的干酶制剂,在75℃85℃95℃下,调质30秒再制粒发现,调质温度在85℃对酶活性无任何影响;另一组试验表明,干酶制剂品在85℃以上调质15分钟仍有一定活力,而95℃则有一定影响。

1.2 pH值对酶制剂稳定性的影响

各种酶制剂都有其最适pH值。如果一种酶制剂具有较宽的保持高活力的pH值范围,同时又适应动物体内消化道内环境的pH值,那么这种酶就能发挥好的作用。在沈水宝(2002)的试验中发现淀粉酶在pH5.07.0,酸性蛋白酶在pH2.54.6;木聚糖酶在pH 5.57.6β-葡聚糖酶在pH6.07.5都有较高的活性,而根据Makkink等(1994)报道,猪十二指肠至空肠的pH值平均为6.4,胃内平均为3.0,说明上述四种酶能在猪的胃肠道发挥作用。同时,酶制剂在一定pH值条件下酶性很低或根本测不出活性。如木聚糖酶和β-葡聚糖酶在胃内条件下即pH4.0时,检测不到活性,而在pH5.5的条件下又表现出活性;同样,酸性蛋白酶在pH2.54.6时表现出较高的活性,而在pH6.0时则活性很低。说明酶制剂能在动物消化道内一定位点保持活性并起到消化作用。

不同来源的酶制剂对pH值的稳定性存在差异。郑祥建、韩正康(1998)用三种β-葡聚糖酶的测定结果表明:Biokyowa β-葡聚糖酶和国产号最pH值是5.0pH 46范围内有较高水平的酶活力;国产β-葡聚糖酶最适pH3.5,在pH 3.54.5活力较高。在我们实验室的试验测定β-葡聚糖酶最适pH值为6.0pH 6.07.5之间维持较高的酶活力水平。因此,应根据酶制剂pH值的稳定性及其对动物消化道内环境pH值的适应性进行选择和使用,才能获得较好的效果。

1.3 离子浓度对酶制剂稳定性的影响

饲料被猪采食后,在胃的酸性条件下(pH=1.53.5)和小肠弱酸性条件(pH=6.0)均要停留一段时间,在这样的环境中,外源酶的加入可能与其中的无机离子之间发生相互作用,从而影响酶活性的发挥。刘强(1998用体外法研究了α-淀粉酶与各种无机离子之间的关系,结果表明:α-淀粉酶随Ca2+浓度(2.5320mmol/L)升高而上升,随Zn2+浓度(0.12.5mmol/L)、Fe2+浓度(0.24.0mmol/L)和Mg2+浓度(5.020mmol/L)升高而降低,其中,随Zn2+浓度变化幅度大于Fe2+ Mg2+Mg2+对淀粉酶活性的影响最小。在我们实验室的试验采用体外法对猪饲料含量较高的二种离子Ca2+Cu2+离子对三种外源酶( α-淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡聚糖酶)活性的影响进行研究,结果显示:钙离子浓度(2.5160mmol/L)对各种酶的活性没有影响;随着铜离子浓度增加(2.5160mmol/L),α-淀粉酶的活性降低,铜离子浓度大于40mmol/L时,检测不出α-淀粉酶的活性;β-葡聚糖酶的活性随铜离子浓度增加而显著降低,当铜离子浓度大于20mmol/L时,活性很低。说明铜离子可以使α-淀粉酶和β-葡聚糖酶失活。酸性蛋白酶表现出完全相反的结果,其活性随Cu2+浓度增加而升高,Cu2+5.0160mmol/L)范围内,其活性是对照组的二倍。饲料进入动物消化道后,经消化道分解之后,其成分相当复杂。就酶制剂而言,其与特定底物、无机离子等之间会存在竞争关系,因而研究无机离子对酶活性的影响还必须注意到酶与底物、酶与无机离子之间的竞争关系,因而离子浓度对酶活的影响及重金属对酶活的影响还有待于进一步的研究加以证实。

1.4 内源蛋白酶对酶制剂稳定性的影响

外源酶一般是由微生物培养而来的一种具催化活性的蛋白质,其本质是蛋白质。当外源酶进入动物消化道后是否受到内源蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)的作用,也是外源酶稳定性的因素之一。郑祥建(1998)用胰蛋白酶对三种β-葡聚糖酶的消化作用表明:胰蛋白酶会分解β-葡聚糖酶,但作用2小时仍可保持77.1%的活力。孙建义等(2002)体外模拟动物胃肠道条件研究里氏木霉GXCβ-葡聚糖酶对内源蛋白酶的耐受性,结果表明:虽然β-葡聚糖酶在胃内活性较低,但能在小肠中恢复,同时,胃蛋白酶和胰蛋白酶对β-葡聚糖酶无降解作用。在我们实验室的试验中,体外模拟动物胃肠道条件研究胃蛋白酶和胰蛋白酶对各种外源酶(α-淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶)的作用,结果发现:α-淀粉酶不能耐受胃蛋白酶的作用,果胶酶会受到胃蛋白酶的分解,酸性蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶对胃蛋白酶的耐受性较好,其中β-葡聚糖酶稳定性最好,纤维素酶被胃蛋白酶的损失率为8%左右,而酸性蛋白酶在2小时之前的损失率为2%4小时的损失率达到16.2%。说明各种酶在胃蛋白酶的作用下会有一定程度的损失。动物消化道内胃蛋白酶的分泌量会受到日粮成分、采食、及应激等因素的影响,同时各种外源酶进入到消化道内会跟各自的底物发生作用。体外法研究证明:酸性蛋白酶和纤维素酶对胰蛋白酶的耐受性好,而α-淀粉酶在温育的60分钟和120分钟酶活损失较大;果胶酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶对胰蛋白酶的耐受性随着温育时间的增加,酶活性有所降低。说明胰蛋白酶会对各种外源酶有一定程度的降解。同样地这种降解的程度会受到动物消化道内胰蛋白酶浓度和各种酶作用底物浓度的影响。

2 酶制剂在动物中应用效果的一般评定方法

2.1 消化试验及代谢试验测定营养物质消化率和代谢率的评定

采用全收粪法,进行代谢试验比较酶对各种营养物质代谢率的影响是常见的一种酶制剂应用效果评定方法。在于旭华(2004)的试验中,在小麦基础日粮中添加木聚糖酶对黄羽肉鸡表观代谢能和能量表观代谢率都有升高的趋势,组~组比对照组提高2%7%,比Hew等(1998)提高的幅度有所降低,这主要与本试验所采用的日粮的能量浓度较高有关,日粮能量浓度较高时,木聚糖酶对日粮能量提升的空间较小,而如果日粮的能量浓度较低,则木聚糖酶对日粮能量提升的空间较大。Carré等(1992)的试验表明,日粮添加阿拉伯木聚糖酶提高了动物的AME,其中淀粉消化率的提高贡献率为35%,而脂肪和蛋白质的贡献率分别为35%30%Hew等(1998)在小麦日粮中添加2种阿拉伯木聚糖酶后,结果日粮中各种氨基酸在粪中的消化率由平均0.70分别提高至0.780.79,将日粮氨基酸回肠末消化率由平均0.78分别提高至0.840.85Steenfeldt等(1998)报道,在3周龄肉鸡小麦基础日粮中添加酶制剂,可以提高粪中蛋白的表观消化率和脂肪的表观消化率,同时也将回肠蛋白和脂肪的表观消化率分别提高6%13%。在于旭华的试验中,添加木聚糖酶对日粮中粗蛋白的真消化率也有不同程度的提高。

2.2 饲养试验测定动物常规生产性能的评定

饲养试验是动物营养试验中最常用、最直接、有时候也是最有效的效果评定方法,酶制剂在日粮中应用效果的评定也不例外。的确,任何的营养措施和配方技术,最终必须要反映在动物饲养的生产效果,反映在动物生产性能(生长性能、增重性能、产奶性能、产蛋性能等等)上,大量的酶制剂在饲料和养殖中应用的报道都反映了这种情况,也是目前绝大多数人评价和判断饲料酶有效性的依据,这种评价和判断不仅在生产实践上,同样也在科学研究上。一般常用的动物生产性能评定指标是狭义上的动物生产性能指标(为了方便,我们可以把狭义上的动物生产性能指标称为常规动物的生产性能指标),主要包括动物生产水平(生长水平、增重水平、产奶水平、产蛋水平等)及其相应的饲料效率(饲料报酬、耗料增重比、料肉比、饵料系数等)。这方面的报道特别多,这里不作更多的讨论。

3 酶制剂应用效果的非常规评定方法

3.1 体外模拟法测定的评定

体外模拟法是评价酶制剂品质的有效方法之一,体外法能够在一定程度上反映酶制剂的作用效果,并与体内结果有较强的一致性。Petterson等(1989)报道,运用体外法能够反映出木聚糖酶和β-葡聚糖酶在黑麦和小麦日粮中NSP的水解情况。GrahamLowgern等(1991)利用体外消化法对β-葡聚糖酶对鸡麦类日粮体内外代谢能消化率回归方程的影响进行了研究,结果说明利用体外法能够反映出β-葡聚糖酶在麦类日粮中的作用效果。Bedford等(1993)研究表明,利用体外法可以对体内小肠食糜的粘性情况进行预测,并能够用来估测在肉仔鸡日粮中添加微生物酶制剂促进生长的能力。Smulikowska等(1992)进行了7种商品酶制剂对黑麦作用的体内外对比研究,发现在体内和体外降低食糜粘性最有效的酶制剂种类是一致的,建议在酶制剂的应用中使用简单的体外模拟法进行检测。Alloui等(1994)和Simbaya等(1996)在酶制剂对菜籽粕NDFADF降解情况的研究中也得出同样的结论。Zhang等(1996)使用对数线性模型体外评价酶制剂的效率,从而预测酶制剂在动物生产上的应用效果。体外法不仅可以快速评定酶制剂的作用效果,也为酶制剂作用机理的研究提供了一种研究手段。Tervilä等(1996)体外模拟肉仔鸡对小麦的消化,结果证明,添加细胞壁降解酶后饲料细胞壁被破坏,大部分蛋白质被释放出来。因此,利用体外模拟法来研究纤维素酶在家禽上的作用效果,以此来解释其作用机理也是可行的方法。Zyla等(1995)提出的体外模拟家禽嗉囊、胃和小肠消化的方法是目前较多采用的方法。在黄燕华(2004)的试验中,即采用Zyla等(1995)的方法对纤维素酶分解纤维饲料的效果及作用机理进行了探讨。体外试验的结果与体内试验有较强的一致性。

3.2 应用加酶日粮ENIV 的评定

添加酶制剂对饲料原料的有效营养改进(ENIV系统)的核心是各种饲料原料在添加特定酶制剂的情况下,可提供额外有效营养量,即ENIV值,ENIV值更直接的作用是在配方设计时考虑更能显示出酶制剂添加的功效,因为在营养水平高的情况下,酶制剂的动物生产效果可能显示不出来。有效营养改进值ENIV也可以用于设计专用酶制剂产品,如果大量的研究和应用已经得到一组饲料原料使用相应酶制剂的ENIV值,其它生产酶制剂产品的厂家设计新的酶制剂所选择单酶的种类及其活性单位时,可以根据ENIV值作为一个重要的参照指标确定酶谱及其有效活性。有关这方面的内容可参考 冯定远和沈水宝(2005)的专门讨论。

3.3 应用非常规动物生产性能指标的评定

我们必须注意到,一方面,目前酶制剂作为一种争论比较多的添加剂,在实际应用时,很难达到理想的效果,许多时候反映出两点:一是生产性能指标的改善往往并不达到生物统计学上的显著水平;二是生产性能的效果并不稳定。动物生产性能并不仅仅是狭义上的生产水平和饲料效率,广义的动物生产性能指标还应该包括其他指标,甚至还包括不能量化的指标(我们可把狭义上以外的其他动物生产性能指标称为非常规动物的生产性能指标),如外观表现、健康状况、整齐度、成活率、同时出栏的比例等等。动物生产性能不仅仅包括动物的生物学方面的性能,还应该包括养殖方面的商品性能、综合经济价值等。这些方面特别容易被忽视,也许这些容易被忽视的性能指标恰恰是更能反映酶制剂这种复杂、变异和多功能的添加剂的效果。所以,我们认为,除了一般常规的评价方法外,有时候需要其他的非常规评定方法,这是建立多层次的饲料酶制剂及其应用效果的评价体系的意义所在。例如,已经证实未消化的可溶性纤维是影响非特异性结肠炎综合症的关键因素,尤其是对于采食小麦基础日粮(颗粒饲料)的体重为1540 kg的猪(Taylor1989)。日粮中添加适宜的木聚糖酶可以改善这种症状(HazzledinePartridge1996),对于已经受到影响的,可以减少粉状饲料的需要量或者重新评估配方的成本。其他的研究也有用酶制剂降低日粮性腹泻的类似报道,尤其是断奶仔猪更明显(InborrOgle1998Florou-Paneri等,1998Kantas等,1998)。未来的养猪生产中抗生素的使用只能是策略性的而不是日常性。上述这些报道,以及酶与治疗或亚治疗剂量的抗生素的具有可能的协同作用的报道(Florou-Paneri等,1998Kantas等,1998Gollnisch等,1996),将为实现未来的养猪生产方式提供非常令人感兴趣的可能性。这时候,使用酶的价值就不能仅仅看增重了。

这里特别要指出,许多的实践经验表明,酶制剂在动物生产中应用具有如下几方面不被重视的表现:一是对日粮组成不十分合理或者配方技术水平不高时,应用有针对性的高效酶制剂可以在一定范围内,达到调整和平衡的作用;二是在饲料原料质量比较差和不稳定的情况下,适当的酶制剂可以达到改善和缓和的效果;三是使用高质量的酶制剂可以提高动物生长增重性能的均一度和外观的整齐度。这三方面的表现之间既有关联,也不完全相同,但都直接与养殖的经济效益密切相关。生长增重性能的均一度可以通过量化指标反映出来,例如,离均差的大小可考虑作为评价酶在动物日粮中应用的辅助指标,甚至是重要的评定指标。也许,这类非常规动物生产性能指标不仅仅可作为酶制剂效果的评定指标,同样可以作为其他饲料添加剂和营养因素的效果的评价指标,在动物营养科学朝着精细化、数据量化的方向发展的趋势下,越来越多人意识到其重要意义。

4 小结

外源酶的作用效果,许多试验得出的结果并不一致,有些结果显著,而另一些试验显示了改善的趋势,但效果不一定显著。对这些观察结果,有许多可能的解释。一般情况下,由于酶的种类、活性以及酶的添加水平不同,很难对不同的试验进行直接比较。即使酶的活性确实(固定的、稳定的),可是酶单位及测定酶活性的方法的差异并不总是恒定不变的。饲料酶制剂和应用条件的复杂性,决定了酶应用效果评价不能仅仅靠常规的评定方法,而必须通过多种评定方法的结合,有时候其他的评定方法更能反映出酶的作用效果,特别是在一般生产指标未达到显著水平时更是如此。因此,建立和推广饲料酶制剂及其应用效果的评价体系十分必要。

(参考文献略,需者可函索)

 

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